双荧光素酶实验是广大科研工作者经常会遇到的实验。双荧光素酶报告基因通常以萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）为报告基因，以海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为内参基因。如此所构成的报告系统有检测灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势。使得双荧光素酶实验广泛应用于miRNA靶基因验证，转录因子调控验证，ceRNA研究等多种研究。

双荧光素酶报告基因检测原理：

将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

应用方向

1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测荧光素活性。
3. 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。
4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。
5. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如，在GPCR研究中，将cAMP response element（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。又如，将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。

载体的选择

根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。而载体的选择，一般来说，萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；海肾荧光素酶建议选取pGL-4代载体或自己构建相应的载体。

研究miRNA的靶基因实验时，这两种载体分别为：

pMIR-REPORT载体：它用来插入miRNA靶序列，评估细胞内miRNA功能。该载体包含一个CMV启动子控制下的萤火虫荧光素酶报告基因。在荧光素酶基因的3'UTR区域包含一个多克隆位点，用于插入预测miRNA的结合靶序列或其他核苷酸序列。若荧光素酶活性下降，说明该段插入序列受到miRNA调节，这模仿了miRNA靶序列的作用方式。

pMIR-REPORT载体

pRL系列载体（以pRL-CMV为例），pRL系列载体可在哺乳动物细胞中组成型地表达海肾荧光素酶。

pRL系列载体

而研究转录因子和启动子的实验时，两种载体分别为：

pGL4.20载体，pGL4.20载体含Luciferase荧光素酶报告基因，无启动子，用于研究目的启动子的功能，在荧光素酶基因的上游包含一个多克隆位点，用于插入启动子序列，若Luciferase荧光素酶活性上升，说明该段启动子受到转录因子的调控。

pRL系列载体。

pGL4.20载体

或者两种荧光素酶位于同一个载体上。这样偏差更小，毕竟转染一个质粒比转染两个质粒要容易，在这方面，根据检索到的资料显示，现在的这类质粒比较有名的是Promega公司的pmirGLO质粒。

pmirGLO质粒

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