原理

乳酸脱氢酶（LDH）是一种氧化还原酶，可催化丙酮酸和乳酸的相互转化以及NADH和NAD+的相互转化。LDH是一种稳定的酶，存在于所有细胞类型中，并在质膜受损后迅速释放到细胞培养基中。因此，LDH是细胞毒性研究中使用最广泛的标记。细胞毒性检测试剂盒（乳酸脱氢酶法）为研究细胞毒性提供了一种简便的比色测定法。该测定基于在典型的细胞毒性测定中，将靶细胞与细胞毒性化学试剂或细胞毒性细胞（NK细胞，细胞毒性T细胞）一起培养，以诱导靶细胞死亡和LDH释放。将含有LDH的上清液转移至新的96孔测定板的孔中，并与LDH Reaction Solution混合。在LDH的作用下，NADH和四唑盐MTT反应生成NAD+ 和MTT的还原形式,该MTT的还原形式在565 nm处表现出最大吸收，产生的颜色强度与裂解的细胞数直接相关。在室温下孵育30分钟后，使用酶标仪读取565 nm的吸光度。

自备耗材

·酶标仪（能测565 nm处的吸光度）及二氧化碳培养箱

·96孔板，透明平底

·平板离心机（可选）

·可调节式移液枪及枪头

·去离子水

实验步骤

A确定药物是否适用该试剂盒

个别药物可能会干扰反应体系，故不适用于该试剂盒，因此，我们建议执行初始预实验，以确定计划使用的目标药物是否适用于该试剂盒，如果预实验显示药物有抑制作用，联系Abbkine技术支持。

1. 培养细胞24 h以上，离心除去颗粒，得到细胞培养上清。

2. 将细胞培养上清加入到96孔细胞培养板中，200 μL/孔，设置6个复孔。

3. 在3个孔中加入20 μL目标药物，另外3孔加入20 μL Assay Buffer作为对照孔。

4. 每孔各取100 μL转移到新的96孔检测板中。

5. 每孔加入100 μL LDH Reaction Solution。

6. 将板在37℃下孵育最多30 min。

7. 用酶标仪读取565 nm处的吸光度。

8. 评估加药孔与对照孔的吸光度，若加药孔明显小于对照孔，说明该药物不适用于该试剂盒。

B样本测定

1. 根据细胞的大小和生长速度确定最佳浓度，将200 μL细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%。

2. 从96孔板中吸出生长培养基。用PBS洗涤细胞一次，然后将生长培养基替换为含1%血清的低血清培养基，再孵育1 h。

3. 将200 μL 1%低血清培养基（无细胞）添加至三个孔作为背景对照和三个孔作为LDH阳性对照（可选做）。

4. 通过所需方法诱导细胞毒性，向适当的孔中一式三份添加20 μL药物。将20 μL的10% Triton X-100溶液添加到三个含有细胞的孔中作为最大释放。将20 μL Assay Buffer添加到三个含有细胞的孔中作为自发释放，同时将20 μL Assay Buffer添加到三个只含1%低血清培养基无细胞的孔中作为背景对照。将20 μL LDH Positive Control添加到三个只含1%低血清培养基无细胞的孔中作为阳性对照。

5. 在37℃的CO2培养箱中孵育平板，使其达到实验所需的的时间。

6. 以400 g的速度离心96孔组织培养板5 min（可选做，但建议做）。

7. 将100 μL细胞上清液转移至新的96孔测定板中。

8. 向每个孔中添加100 μL LDH Reaction Solution。

9. 在37℃下孵育平板最多30 min。

10. 用酶标仪读取565 nm处的吸光度。

11. 从所有孔中减去背景A565水平。

注意：加入药物浓度应是反应体系的终浓度。每个实验的结果计算为“细胞毒性百分比”，或靶细胞中所含LDH总量的百分比。 因此，对于每个实验，必须有一组对照孔，其中使用试剂盒中提供的10% Triton X-100溶液杀死所有靶细胞。 这些就是“最大释放量”。同样，在每个实验中，必须有一组对照孔，其中未添加细胞毒性剂或细胞毒性细胞，从而导致最低的（自发的）LDH释放，就是“自发释放”细胞孔。 用细胞毒剂处理的细胞将释放一定数量的LDH，该数量介于最大释放水平和自发释放水平之间。

结果计算

以下公式计算为“细胞毒性百分比”

细胞毒性百分比 (%) =(A样本－A自发) / (A最大释放－A自发)×100

A样本，毒性试剂处理样本在565 nm处的吸光度；A自发，样本在565 nm处自发释放的吸光度；A最大释放，样本在565 nm处最大释放的吸光度。

注意事项

1. 不同批次号、不同的厂家的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

2. 混合或复溶组分时，避免产生气泡。

3. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。

4. 实验开始前，确保所有的组分及设备处于合适的温度。

5. 保持好的实验习惯，穿戴好手套、实验服、口罩、防目镜等防护工具后再开始实验。

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