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Caspase-3活性分析试剂盒(比色法)实验操作步骤

发布时间:2025-01-23 浏览次数:301



原理

半胱氨酸蛋白酶的Caspase家族已显示在凋亡中起关键作用。 哺乳动物Caspase可分为三个功能组:启动子半胱天冬酶(Caspase-2、8、9和10),执行者半胱天冬酶(Caspase-3、6和7)和炎性半胱天冬酶(Caspase-1、4、5、11 和 12)。Caspase-3(也称为Yama,CPP32和Apopain)在天冬氨酸残基的羧基末端切割其底物。 活性Caspase-3由两组同源二聚体(17和12 kDa)组成,它们均来自两个前体Caspase-3 多肽,并具有两个活性位点。Caspase-3与Caspases-8 和9一起位于细胞凋亡途径的关键连接点。Caspase-3活性分析试剂盒(比色法)基于Caspase -3水解肽底物 Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-对硝基苯胺),产生黄色的对硝基苯胺(pNA),pNA在405 nm附近有强吸收,从而可以通过测定吸光度来检测Caspase -3的活性。

自备耗材

·酶标仪(能测405 nm处的吸光度)

·96孔板

·低温离心机、制冰机

·可调节式移液及枪头

·去离子水、磷酸盐缓冲液 (PBS)

·匀浆器(如果是组织样本

试剂准备

Working Cell Lysis Buffer: 使用前立即加入DTT(最终浓度:每1 mL Cell Lysis Buffer加10 µL DTT(100×))置于冰上4保存。

Working Reaction Buffer (1×): 使用前,用去离子水稀释到Reaction Buffer (1×),再加入DTT(最终浓度:每1 mL Reaction Buffer (1×)加10 µL DTT(100×))置于冰上4保存。

Ac-DEVD-pNA (4 mM): 即用型;使用前,置于冰上–20保存。用不完的试剂-20避光分装保存,避免反复冻融。

pNA (10 mM): 即用型;使用前,置于冰上–20避光保存。用不完的试剂-20避光分装保存,避免反复冻融。

DTT (100×): 即用型;使用前,置于冰上–20保存。用不完的试剂-20分装保存,避免反复冻融。

Standard设置Reaction Buffer (1×,含DTT)将标准品pNA (10 mM)稀释为200、100、50、20、10、0 µM的标准溶液。

样本制备

注意:我们建议使用新鲜样品。或按照“样本制备”将样品保存在-80。使用前,在冰上解冻,这可能会影响样品的稳定性,并且读数可能会低于预期。此试剂盒可检测蛋白水解活性。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂,它可能会干扰测定。

1. 通过所需方法诱导细胞凋亡。同时,建议对每个Caspase-3比色测定法设置不的对照培养。

2. 对于贴壁细胞,胰蛋白酶消化收集细胞。600 g4离心5 min小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后,去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×106个细胞。

3. 对于悬浮细胞,600 g4离心5 min小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后,去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×106个细胞。

4. 对于组织,将5-20 mg组织切成小块,用PBS清洗组织,加入0.1 mL Working Cell Lysis Buffer,冰浴匀浆。

5. 裂解物冰上孵育15-20 min。

6. 16,000 g4离心15 min,然后将上清液转移至新试管中,置冰上待测。

7. 立即测定Caspase-3的酶活性或-80保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。

注意:如需测定蛋白浓度,推荐使用Abbkine货号:KTD3002的蛋白质定量试剂盒(Bradford法)进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪预热30 min以上,调节波长到405 nm。

2. 操作表(下述操作在96孔板中操作):

 

空白孔μL)

标准孔μL)

测定孔μL)

Working Reaction Buffer (1×,含DTT)

100

50

50

Standard

0

50

0

上清

0

0

50

Ac-DEVD-pNA (4 mM)

5

5

5

3. 混匀,37孵育1-2 h,检测405 nm处吸光值。空白孔记为A,标准孔记为A、测定孔记为A。计算ΔA=A-AΔA=A-A

注意:1.空白孔只需测定 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验;2.在反应体系中,适当混匀,注意避免在混匀时产生气泡;3.发现颜色变化比较明显时即可测定405 nm的波长。如果颜色变化不明显,可以适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜。

结果计算

注意:我们为您提供的计算公式,包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 按标准曲线计算

以标准溶液浓度为x轴,ΔAy轴,绘制标准曲线y=kx+b。将样本的ΔA带入方程得到x值(μM)。

2. 按酶活性增加百分比计算

Caspase-3活性增加百分比=(实验处理组A测定-A空白)/(实验对照组A测定-A空白)×100%

该方法简单可靠,可粗略反应酶活性情况。

3. 按酶活计算

参考 Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在37一个小时内可以剪切1 nmol pNA底物产生1 nmol游离pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的Caspase酶活性。

Caspase-3活性(U/mg prot)=x×V反总÷(V×Cpr)÷T×103=2.1×x÷Cpr÷T

V反总:反应体系总体积,0.105 mL=1.05×10-4 L;V:加入的样本体积,0.05 mL;T:反应时间,h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;103:单位换算系数,1 μmol =103 nmol

注意:对于样品中Caspase-3酶活力特别高的情况,须用Working Cell Lysis Buffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数n。

相关产品

Catalog No.

Product Name

KTA3020

Caspase-1活性分析试剂盒(比色法)

KTA3023

Caspase-4活性分析试剂盒(比色法)

KTA3025

Caspase-8活性分析试剂盒(比色法)


 

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