Caspase-3活性分析试剂盒(比色法)实验操作步骤
原理
半胱氨酸蛋白酶的Caspase家族已显示在凋亡中起关键作用。 哺乳动物Caspase可分为三个功能组:启动子半胱天冬酶(Caspase-2、8、9和10),执行者半胱天冬酶(Caspase-3、6和7)和炎性半胱天冬酶(Caspase-1、4、5、11 和 12)。Caspase-3(也称为Yama,CPP32和Apopain)在天冬氨酸残基的羧基末端切割其底物。 活性Caspase-3由两组同源二聚体(17和12 kDa)组成,它们均来自两个前体Caspase-3 多肽,并具有两个活性位点。Caspase-3与Caspases-8 和9一起位于细胞凋亡途径的关键连接点。Caspase-3活性分析试剂盒(比色法)基于Caspase -3水解肽底物 Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-对硝基苯胺),产生黄色的对硝基苯胺(pNA),pNA在405 nm附近有强吸收,从而可以通过测定吸光度来检测Caspase -3的活性。
自备耗材
·酶标仪(能测405 nm处的吸光度)
·96孔板
·低温离心机、制冰机
·可调节式移液枪及枪头
·去离子水、磷酸盐缓冲液 (PBS)
·匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
Working Cell Lysis Buffer: 使用前,立即加入DTT(最终浓度:每1 mL Cell Lysis Buffer加10 µL DTT(100×)),置于冰上;4℃保存。
Working Reaction Buffer (1×): 使用前,用去离子水稀释到Reaction Buffer (1×),再加入DTT(最终浓度:每1 mL Reaction Buffer (1×)加10 µL DTT(100×)),置于冰上;4℃保存。
Ac-DEVD-pNA (4 mM): 即用型;使用前,置于冰上;–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存,避免反复冻融。
pNA (10 mM): 即用型;使用前,置于冰上;–20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存,避免反复冻融。
DTT (100×): 即用型;使用前,置于冰上;–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存,避免反复冻融。
Standard设置:用Reaction Buffer (1×,含DTT)将标准品pNA (10 mM)稀释为200、100、50、20、10、0 µM的标准溶液。
样本制备
注意:我们建议使用新鲜样品。或按照“样本制备”将样品保存在-80℃。使用前,在冰上解冻,这可能会影响样品的稳定性,并且读数可能会低于预期。此试剂盒可检测蛋白水解活性。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂,它可能会干扰测定。
1. 通过所需方法诱导细胞凋亡。同时,建议对每个Caspase-3比色测定法设置不的对照培养。
2. 对于贴壁细胞,胰蛋白酶消化收集细胞。600 g,4℃离心5 min,小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后,去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×106个细胞。
3. 对于悬浮细胞,600 g,4℃离心5 min,小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后,去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×106个细胞。
4. 对于组织,将5-20 mg组织切成小块,用PBS清洗组织,加入0.1 mL Working Cell Lysis Buffer,冰浴匀浆。
5. 裂解物冰上孵育15-20 min。
6. 16,000 g,4℃离心15 min,然后将上清液转移至新试管中,置冰上待测。
7. 立即测定Caspase-3的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。
注意:如需测定蛋白浓度,推荐使用Abbkine货号:KTD3002的蛋白质定量试剂盒(Bradford法)进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪预热30 min以上,调节波长到405 nm。
2. 操作表(下述操作在96孔板中操作):
| 空白孔(μL) | 标准孔(μL) | 测定孔(μL) |
Working Reaction Buffer (1×,含DTT) | 100 | 50 | 50 |
Standard | 0 | 50 | 0 |
上清 | 0 | 0 | 50 |
Ac-DEVD-pNA (4 mM) | 5 | 5 | 5 |
3. 混匀,37℃孵育1-2 h,检测405 nm处吸光值。空白孔记为A空,标准孔记为A标、测定孔记为A测。计算ΔA测=A测-A空,ΔA标=A标-A空。
注意:1.空白孔只需测定 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验;2.在反应体系中,适当混匀,注意避免在混匀时产生气泡;3.发现颜色变化比较明显时即可测定405 nm的波长。如果颜色变化不明显,可以适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜。
结果计算
注意:我们为您提供的计算公式,包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1. 按标准曲线计算
以标准溶液浓度为x轴,ΔA标为y轴,绘制标准曲线y=kx+b。将样本的ΔA测带入方程得到x值(μM)。
2. 按酶活性增加百分比计算
Caspase-3活性增加百分比=(实验处理组A测定-A空白)/(实验对照组A测定-A空白)×100%
该方法简单可靠,可粗略反应酶活性情况。
3. 按酶活计算
参考 Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在37℃一个小时内可以剪切1 nmol pNA底物产生1 nmol游离pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的Caspase酶活性。
Caspase-3活性(U/mg prot)=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T×103=2.1×x÷Cpr÷T
V反总:反应体系总体积,0.105 mL=1.05×10-4 L;V样:加入的样本体积,0.05 mL;T:反应时间,h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;103:单位换算系数,1 μmol =103 nmol。
注意:对于样品中Caspase-3酶活力特别高的情况,须用Working Cell Lysis Buffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数n。
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