谷丙转氨酶（ALT/GPT）活性检测试剂盒实验解决方案
发布时间：2025-02-12
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原理
谷丙转氨酶（ALT/GPT）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化可逆转氨基反应，是氨基酸代谢的重要酶。血清ALT活性水平是肝脏损伤的重要生化指标，可反映肝脏受损的严重程度。此外，ALT在心肌细胞中含量最高，临床上一般常作为心肌梗塞和心肌炎的辅助检查。CheKine™ 谷丙转氨酶（ALT/GPT）活性检测试剂盒（微量法）提供了一种简单的检测方法检测生物样本如血清（浆）、动植物组织、细胞、细菌中谷丙转氨酶（ALT/GPT）的活性水平。谷丙转氨酶（ALT/GPT）在37℃及pH7.4条件下，催化α-酮戊二酸和丙氨酸发生转氨基反应，生成谷氨酸和丙酮酸；丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸苯腙，在碱性条件下显棕红色，于505 nm测定吸光度，即可计算ALT/GPT酶活力。
自备耗材
·酶标仪或可见分光光度计（能测505 nm处的吸光度）
·水浴锅、制冰机、低温离心机
·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
·去离子水
·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
Standard：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
标准品准备：按下表混合Standard和ReagentⅠ，得到相应浓度的标准孔。
Standard（μL） | ReagentⅠ（μL） | Standard浓度（μmol/mL） |
22.5 | 7.5 | 1.5 |
15 | 15 | 1 |
12 | 18 | 0.8 |
6 | 24 | 0.4 |
3 | 27 | 0.2 |
1.5 | 28.5 | 0.1 |
0.75 | 29.25 | 0.05 |
0 | 30 | 0 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4 h之内使用。
样本制备
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。
1.动物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
2.植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
3.细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30 次），8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
4.血清（浆）：直接测定。
注意：如需样本蛋白浓度测定，推荐使用Abbkine BCA法蛋白质定量试剂盒，货号为KTD3001。该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1420（谷草转氨酶）的测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长至505 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2.在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂：
试剂 | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） | 标准孔（μL） |
样本 | 5 | 0 | 0 |
ReagentⅠ | 25 | 25 | 0 |
不同浓度Std. | 0 | 0 | 30 |
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热30 min | |||
ReagentⅡ | 25 | 25 | 25 |
样本 | 0 | 5 | 0 |
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20 min | |||
ReagentⅢ | 240 | 240 | 240 |
混匀，室温静置10 min，在505 nm波长处测定各孔的OD值，记为OD测定、OD对照、OD标准, 计算ΔOD测定=OD测定-OD对照、ΔOD标准=OD标准-OD空白。
注意：1. 每个样本均需要做对照孔。0 µmol/mL标准孔为空白孔。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。2. 如果ΔOD测大于浓度为1.5 μmol/mL标准品的ΔOD标，则需要用Extraction Buffer稀释样本后，重新检测。如果样本的ΔOD测低于0.05 μmol/mL标准品的ΔOD标，可提高样本量。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
标准曲线的绘制：
以标准液浓度为y轴，ΔOD标准为x轴，绘制标准曲线。将ΔOD测定带入方程计算出y (µmol/mL)。
1.血清（浆）样本GPT的活性
单位定义：每小时每mL血清（浆）样品催化产生1 µmol丙酮酸的量为一个GPT活力单位。
GPT(U/mL)=y×(V样本+VReagentⅠ)÷V样本÷T=12y
2.组织、细菌或细胞GPT的活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生1 µmol丙酮酸的量为一个GPT活力单位。
GPT(U/mg prot)=y×(V样本+VReagentⅠ)÷(Cpr × V样本)÷T=12y÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每小时每g鲜重样品催化产生1 µmol丙酮酸的量为一个GPT活力单位。
GPT(U/g 鲜重)=y×(V样本+VReagentⅠ)÷(W×V样本÷V样总)÷T=12y÷W
（3）按细菌或细胞数量计算：
单位定义：每小时每104个细菌或细胞催化产生1 µmol丙酮酸的量为一个GPT活力单位。
GPT(U/104 )=y×(V样本+VReagentⅠ)÷(500÷V样本÷V样总)÷T=0.024y
V样本：样本体积，0.005 mL；VReagentⅠ：加入RegentⅠ体积，0.025 mL；V样总：Extraction Buffer体积，1 mL；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，0.5 h；500：细菌或细胞总数量，500万个。
结果展示
典型标准曲线：
Figure 1. GPT的标准曲线，数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
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Catalog No. | Product Name |
KTB1420 | CheKine™谷草转氨酶（AST/GOT）活性检测试剂盒（微量法） |
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