
原理
游离脂肪酸(FFA),也称为非酯化脂肪酸,既是脂肪水解的产物,又是脂肪合成的底物,在与白蛋白结合的血浆中循环。血清中FFA的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关,FFA的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升。CheKine™ 游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒(微量法)可检测血清(浆)、动植物组织、细胞、细菌等样本中游离脂肪酸含量,其原理是FFA与铜离子结合形成脂肪酸铜盐,并溶于氯仿;利用铜试剂法测定铜离子含量,即可推算出游离脂肪酸含量。
自备耗材
·酶标仪或可见分光光度计(能测550 nm处的吸光度)
·恒温箱、制冰机、低温离心机
·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
·匀浆器(如果是组织样本)
·玻璃瓶(用于配制提取液)
·正庚烷、无水甲醇、氯仿(三氯甲烷)
试剂准备
Extraction Buffer(自备):取一个玻璃瓶,按照氯仿:正庚烷:无水甲醇=28:21:1的比例配制,盖紧后混匀,4℃避光保存。
Cu Reagent:即用型;使用前,平衡到室温;混匀后使用,4℃避光保存。
Chromogen:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
Standard:临用前配制,加1 mL Extraction Buffer,充分溶解得到64 mM Standard,未用完的已溶解的Standard可装于玻璃瓶中盖紧密封,4℃避光保存1个月。
标准曲线设置:把64 mM标准品按下表所示,用Extraction Buffer进行下一步稀释。
序号 | 标准品体积 | Extraction Buffer体积(µL) | 标准品浓度(mM) |
Std.1 | 20 µL of 64 mM | 620 | 2 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (2 mM) | 100 | 1 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (1 mM) | 100 | 0.5 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (0.5 mM) | 100 | 0.25 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (0.25 mM) | 100 | 0.125 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (0.125 mM) | 100 | 0.0625 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (0.0625 mM) | 100 | 0.0313 |
注意:每次实验,请使用新稀释的标准品。
样本制备
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。
1.动物组织:称取约0.1 g样本,加入1 mL Extraction Buffer,冰浴匀浆,8,000 rpm,4℃离心10 min,取上清液,置冰上待测。
2.植物组织:称取约0.1 g样本,加入1 mL Extraction Buffer捣碎,冰浴超声波破碎 5 min(功率20%或200 W,超声3 s,间隔7 s,重复30次),8,000 rpm,4℃离心10 min,取上清液,置冰上待测。
3.细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1 mL Extraction Buffer,冰浴超声波破碎 5 min(功率20%或200 W,超声3 s,间隔7 s,重复30次),8,000 rpm,4℃离心10 min,取上清液,置冰上待测。
4.血清(浆)等液体:直接测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上,调节波长到550 nm,可见分光光度计用去离子水调零。
2.样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):
试剂 | 空白管(μL) | 标准管(μL) | 测定管(μL) |
Extraction Buffer | 240 | 200 | 200 |
不同浓度Std. | 0 | 40 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 40 |
混匀后盖紧瓶盖,置于涡旋混合器上中速涡旋30 s |
Cu Reagent | 80 | 80 | 80 |
混匀后盖紧瓶盖,置于涡旋混合器上中速涡旋30 s,室温(25℃)放置20 min;2,000 g,室温(25℃)离心5 min |
上层溶液 | 50 | 50 | 50 |
Chromogen | 200 | 200 | 200 |
3.室温(25℃)放置5 min。每管取出200 μL加入96孔板或微量玻璃比色皿对应的孔中,于550 nm测定吸光值,计算ΔA测=A测-A空、ΔA标=A标-A空(空白管只需做1管)。显色后务必在30 min内测完。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验,如果A测定大于酶标仪检测范围,样本可用Extraction Buffer进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
注意:我们为您提供的计算公式,包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1.标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴,ΔA标为x轴绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将ΔA测带入标准曲线公式计算出y (mM)。
2.样本FFA含量计算
(1) 按样本质量计算
FFA含量(μmol/g质量)=y×V提取÷W×n=y÷W×n
(2) 按细菌或细胞数量计算
FFA含量(μmol/104)=y÷(细胞或细菌数量÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n
(3) 按液体体积计算
FFA含量(μmol/L)=1,000×y×n
V提取:加入提取液体积,1 mL;W:样本质量,g;n:样本进一步稀释的稀释倍数;500:细菌或细胞总数,500万个;1,000:单位换算系数,1 L=1,000 mL。
结果展示
典型标准曲线
Figure 1. 96孔板分析的游离脂肪酸(FFA)标准曲线。数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线
实验实例:
Figure 2. 试剂盒测定小鼠肝、绿萝中游离脂肪酸(FFA)的含量
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