加入收藏 欢迎光临Abbkine Scientific Co., Ltd官方网站全国服务热线:400-6800-830
登录 注册
中文

亚科因(Abbkine)—服务于细胞和蛋白研究全球用户

游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒实验解决方案

发布时间:2025-02-12 浏览次数:384

原理
游离脂肪酸(FFA),也称为非酯化脂肪酸,既是脂肪水解的产物,又是脂肪合成的底物,在与白蛋白结合的血浆中循环。血清中FFA的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关,FFA的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升。CheKine™  游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒(微量法)可检测血清(浆)、动植物组织、细胞、细菌等样本中游离脂肪酸含量,其原理是FFA与铜离子结合形成脂肪酸铜盐,并溶于氯仿;利用铜试剂法测定铜离子含量,即可推算出游离脂肪酸含量。

自备耗材
·酶标仪或可见分光光度计(能测550 nm处的吸光度)
·恒温箱、制冰机、低温离心机
·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
·匀浆器(如果是组织样本)
·玻璃瓶(用于配制提取液)
·正庚烷、无水甲醇、氯仿(三氯甲烷)

试剂准备
Extraction Buffer(自备):取一个玻璃瓶,按照氯仿:正庚烷:无水甲醇=28:21:1的比例配制,盖紧后混匀,4℃避光保存。
Cu Reagent:即用型;使用前,平衡到室温;混匀后使用,4℃避光保存。
Chromogen:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
Standard:临用前配制,加1 mL Extraction Buffer,充分溶解得到64 mM Standard,未用完的已溶解的Standard可装于玻璃瓶中盖紧密封,4℃避光保存1个月。
标准曲线设置:把64 mM标准品按下表所示,用Extraction Buffer进行下一步稀释。

序号

标准品体积

Extraction Buffer体积(µL)

标准品浓度(mM)

Std.1

20 µL of 64 mM

620

2

Std.2

100 µL of Std.1 (2 mM)

100

1

Std.3

100 µL of Std.2 (1 mM)

100

0.5

Std.4

100 µL of Std.3 (0.5 mM)

100

0.25

Std.5

100 µL of Std.4 (0.25 mM)

100

0.125

Std.6

100 µL of Std.5 (0.125 mM)

100

0.0625

Std.7

100 µL of Std.6 (0.0625 mM)

100

0.0313


注意:每次实验,请使用新稀释的标准品。

样本制备
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。
1.动物组织:称取约0.1 g样本,加入1 mL Extraction Buffer,冰浴匀浆,8,000 rpm,4℃离心10 min,取上清液,置冰上待测。
2.植物组织:称取约0.1 g样本,加入1 mL Extraction Buffer捣碎,冰浴超声波破碎 5 min(功率20%或200 W,超声3 s,间隔7 s,重复30次),8,000 rpm,4℃离心10 min,取上清液,置冰上待测。
3.细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1 mL Extraction Buffer,冰浴超声波破碎 5 min(功率20%或200 W,超声3 s,间隔7 s,重复30次),8,000 rpm,4℃离心10 min,取上清液,置冰上待测。
4.血清(浆)等液体:直接测定。

实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上,调节波长到550 nm,可见分光光度计用去离子水调零。
2.样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):

试剂

空白管(μL)

标准管(μL)

测定管(μL)

Extraction Buffer

240

200

200

不同浓度Std.

0

40

0

样本

0

0

40

混匀后盖紧瓶盖,置于涡旋混合器上中速涡旋30 s

Cu Reagent

80

80

80

混匀后盖紧瓶盖,置于涡旋混合器上中速涡旋30 s,室温(25℃)放置20 min;2,000 g,室温(25℃)离心5 min

上层溶液

50

50

50

Chromogen

200

200

200


3.室温(25℃)放置5 min。每管取出200 μL加入96孔板或微量玻璃比色皿对应的孔中,于550 nm测定吸光值,计算ΔA测=A测-A空、ΔA标=A标-A空(空白管只需做1管)。显色后务必在30 min内测完。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验,如果A测定大于酶标仪检测范围,样本可用Extraction Buffer进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。

结果计算
注意:我们为您提供的计算公式,包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1.标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴,ΔA标为x轴绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将ΔA测带入标准曲线公式计算出y (mM)。
2.样本FFA含量计算
(1) 按样本质量计算
FFA含量(μmol/g质量)=y×V提取÷W×n=y÷W×n
(2) 按细菌或细胞数量计算
FFA含量(μmol/104)=y÷(细胞或细菌数量÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n
(3) 按液体体积计算
FFA含量(μmol/L)=1,000×y×n
V提取:加入提取液体积,1 mL;W:样本质量,g;n:样本进一步稀释的稀释倍数;500:细菌或细胞总数,500万个;1,000:单位换算系数,1 L=1,000 mL。

结果展示
典型标准曲线
Figure 1. 96孔板分析的游离脂肪酸(FFA)标准曲线。数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线
实验实例:
Figure 2. 试剂盒测定小鼠肝、绿萝中游离脂肪酸(FFA)的含量

相关产品

Catalog No.

Product Name

KTB2200

CheKine甘油三酯(TG)检测试剂盒(微量法)

KTB2210

CheKine游离胆固醇(FC)检测试剂盒(微量法)

KTB2220

CheKine总胆固醇(TC)检测试剂盒(微量法)



意见反馈
在线咨询
扫码关注

微信公众号

返回顶部